Los hermanos ítalo-estadounidenses Mario y Luigi comenzaron recientemente su negocio de plomería en Brooklyn, Nueva York. El negocio tiene problemas y su padre desaprueba la decisión de Mario de dejar su trabajo estable bajo el antagonista Spike. Después de ver una fuga importante en las alcantarillas en las noticias, Mario y Luigi van al subsuelo para arreglarlas, pero ambos son absorbidos por una tubería y separados en el proceso.
Mario aterriza en el Reino Champiñón, gobernado por la Princesa Peach, mientras que Luigi aterriza en las Tierras Oscuras, gobernadas por el rey de los Koopas, Bowser. Bowser busca casarse con Peach y destruirá el Reino Champiñón usando la Superestrella si ella se niega. Bowser encarcela a Luigi para chantajear a Mario, a quien ve como una competencia por el amor de Peach. Mario conoce a Toad, quien lo lleva a Peach. Peach planea aliarse con los Kongs para ayudar a repeler a Bowser y acepta llevar a Mario y Toad. Peach también revela que terminó en el Reino Champiñón cuando era un bebé, donde los Toads la acogieron y finalmente la convirtieron en su líder. En el Reino de la Jungla, el rey Cranky Kong acepta ayudarles con la condición de que Mario derrote a su hijo, Donkey Kong, en una pelea. Después de un comienzo inestable, Mario derrota a Donkey Kong después de convertirse en Mario Felino.
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